Importance of the putative furin recognition site 742RNRR745 for antiangiogenic Sema3C activity in vitro

Angiogenesis is one of the key processes in the growth and development of tumors. Class-3 semaphorins (Sema3) are characterized as axon guidance factors involved in tumor angiogenesis by interacting with the vascular endothelial growth factor signaling pathway. Sema3 proteins convey their regulatory signals by binding to neuropilins and plexins receptors, which are located on the effector cell. These processes are regulated by furin endoproteinases that cleave RXRR motifs within the Sema, plexin-semaphorins-integrin, and C-terminal basic domains of Sema3 protein. Several studies have shown that the furin-mediated processing of the basic domain of Sema3F and Sema3A is critical for association with receptors. It is unclear, however, if this mechanism can also be applied to other Sema3 proteins, including the main subject of this study, Sema3C. To address this question, we generated a variant of the full-length human Sema3C carrying point mutation R745A at the basic domain at the hypothetical furin recognition site 742RNRR745, which would disable the processing of Sema3C at this specific location. The effects produced by this mutation were tested in an in vitro angiogenesis assay together with the wild-type Sema3C, Sema3A, and Sema3F proteins. Our results showed that the inhibitory effect of Sema3C on microcapillary formation by human umbilical vein endothelial cells could be abrogated upon mutation at the Sema3C basic domain within putative furin cleavage site 742RNRR745, indicating that this site was essential for the Sema3 biological activity.

Quality of bevacizumab (Avastin®) repacked in single-use glass vials for intravitreal administration / Avaliação da qualidade do bevacizumabe (Avastin®) fracionado em frascos de vidro de dose única para administração intravítrea

ABSTRACT Purpose: Avastin® (bevacizumab) is an anti-vascular endothelial growth factor (VEGF) monoclonal antibody given as an off-label drug by intravitreal administration for treatment of ocular diseases. The drug's clinical application and its cost-benefit profile has generated demand for its division into single-use vials to meet the low volume and low-cost doses necessary for intraocular administration. However, the safety of compounding the drug in single-use vials is still under discussion. In this study, the stability and efficacy of Avastin® repacked in individual single-use glass vials and glass ampoules by external compounding pharmacies were evaluated. Methods: Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), size-exclusion chromatography (SEC), dynamic light scattering (DLS), and turbidimetry were selected to detect the formation of aggregates of various sizes. Changes in bevacizumab biological efficacy were investigated by using an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Results: Repacked and reference bevacizumab showed similar results when analyzed by PAGE. By SEC, a slight increase in high molecular weight aggregates and a reduction in bevacizumab monomers were observed in the products of the three compounding pharmacies relative to those in the reference bevacizumab. A comparison of repacked and reference SEC chromatograms showed that the mean monomer loss was ≤1% for all compounding pharmacies. Protein aggregates in the nanometer- and micrometer-size ranges were not detected by DLS and turbidimetry. In the efficacy assay, the biological function of repacked bevacizumab was preserved, with <3% loss of VEGF binding capacity relative to that of the reference. Conclusion: The results showed that bevacizumab remained stable after compounding in ampoules and single-use glass vials; no significant aggregation, fragmentation, or loss of biological activity was observed.

RESUMO Objetivos: Avastin® (bevacizumabe) é um anticorpo monoclonal inibidor do fator de crescimento endotelial de vasos (VEGF) utilizado "off-label" por meio de administração intravítrea para o tratamento de doenças oculares. A sua aplicação clínica associada ao custo-benefício do medicamento gerou uma demanda para seu fracionamento em frascos de dose única para utilização pela via intraocular. No entanto, a segurança do fracionamento do anticorpo em frascos de dose única ainda é alvo de discussão. Neste trabalho, a estabilidade e a eficácia do Avastin® fracionado em frascos ou ampolas de vidro de dose unitária por farmácias de manipulação do mercado foram avaliadas. Métodos: As técnicas de eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE), cromatografia por exclusão de tamanho (SEC), espalhamento dinâmico da luz (DLS) e turbidimetria foram empregadas para avaliar a formação de agregados de diferentes tamanhos. Alterações na atividade biológica do bevacizumabe foram estudadas utilizando ELISA. Resultados: Amostras referência e do bevacizumabe fracionado apresentaram resultados semelhantes quando analisado por gel de poliacrilamida. Por cromatografia por exclusão de tamanho, um pequeno aumento na quantidade de agregados de alta massa molar seguido de uma redução nos monômeros do bevacizumabe foram observados para as amostras das três farmácias de manipulação quando comparado ao referência. A comparação dos cromatogramas mostrou uma quantidade de redução do monômero inferior a 1% para todas as amostras fracionadas. Por espalhamento dinâmico da luz e turbidimetria, não foram detectados agregados de proteína na faixa de tamanho de micrômetro e nanômetro. No ensaio de eficácia, o bevacizumabe fracionado preservou sua função biológica pois apresentou menos de 3% de perda na capacidade de ligação ao VEGF quando comparado ao referência. Conclusão: Este estudo sugere que o bevacizumabe se mantem estável após fracionamento em ampolas e frascos de vidro de dose unitária pois não foram observadas agregação e/ou fragmentação de proteínas e perda de atividade biológica em quan tidades significativas.

Importância do domínio extracelular do receptor tirosina quinase Tie1 na angiogênese / The importance of Tyrosine Kinase Receptor Tie1 extracellular domain in angiogenesis

Tie1 é um receptor tirosina quinase expresso em células endoteliais importante em angiogênese, formação de vasos sanguíneos a partir de vasos pré-existentes. Este receptor pertence a uma família pequena composta por apenas dois membros (Tie1 e Tie2) para os quais angiopoietinas foram identificadas como ligantes de Tie2. No entanto, Tie1 continua a ser um receptor órfão, sem ligantes identificados até o momento. Sendo assim, é difícil compreender completamente as propriedades biológicas de Tie1 e seus mecanismos moleculares em angiogênese sem um ligante identificado. Entretanto, como sugerido através de estudos de deleção gênica, este receptor é uma molécula essencial na angiogênese, apresentando um papel importante no desenvolvimento da vascularização da retina e desenvolvimento de tumores. O nosso objetivo foi estudar a participação do domínio extracelular de Tie1 na neovascularização e, no processo, identificar possíveis ligantes para este receptor. Através da tecnologia de phage display, identificamos um peptídeo específico e seletivo para Tie1, sugerindo a existência de um sítio de ligação único neste receptor. Mostramos que este peptídeo é capaz de inibir a proliferação de células endoteliais induzida por Ang1, um ligante bem caracterizado de Tie2 que também modula a atividade de Tie1. Além disso, também mostramos que este peptídeo inibe a angiogênese in vivo num modelo animal bastante relevante para estudo de doenças humanas, o modelo da retinopatia induzida por oxigênio. Uma vez que este peptídeo liga-se a um sítio único e seletivo para Tie1, hipotetizamos que o mesmo poderia mimetizar possíveis ligantes naturais deste receptor. Para identificá-los, proteínas com mimetopo cruzado com este peptídeo foram identificadas em extrato proteico de diferentes linhagens celulares. Tais proteínas são possíveis candidatos a interação com Tie1. Em resumo, demonstramos que o domínio extracelular de Tie1 é importante para a angiogênese patológica e identificamos proteínas como possíveis ligantes deste receptor, o que poderá contribuir para um melhor entendimento da participação de Tie1 na formação de vasos. O peptídeo aqui identificado poderá ser ainda uma ferramenta útil para o desenvolvimento de novas terapias anti-angiogênicas com importantes aplicações à saúde humana

Tie1 is a tyrosine kinase receptor expressed by endothelial cells and important in angiogenesis, the formation of new blood vessels from pre-existing ones. This receptor belongs to a small family of receptors composed of two members only (Tie1 and Tie2) to which angiopoietins have been identified as ligands for Tie2. On the other hand, Tie1 is still an orphan receptor with no ligand identified to date. Thus, it is difficult to assess Tie1 mechanism of action in neovascularization without a known ligand. Nevertheless, gene deletion studies have shown that Tie1 is essential in angiogenesis, and plays an important role in retinal and tumoral vascularization. The aim of our study was to evaluate the participation of Tie1 extracellular domain in angiogenesis, and in the process, to identify putative ligands for this receptor. Utilizing phage display, we have identified and characterized a Tie1 specific and selective ligand peptide, which suggests the existence of a binding site unique to this receptor and not shared by other family members. We show that this peptide prevents endothelial cells proliferation, induced by angiopoetin-1, a ligand for Tie2 but which also modulates Tie1 activity. Using a well-accepted mouse model for human diseases, the oxygen induced retinopathy model, we show that this peptide inhibits angiogenesis in vivo. Since this peptide maps to a unique binding site in Tie1, we hypothesized that it might mimic a natural ligand for this receptor. To identify them, proteins with cross reactive epitopes with an anti-peptide sera were identified by proteomic approaches. These proteins are thus possible ligands for Tie1. In summary, we have shown that Tie1 extracellular domain is important in angiogenesis and we have identified putative ligand for this receptor, which might contribute to a better understanding of the molecular mechanisms associated with Tie1 in blood vessel formation. The peptide here characterized may also be an important tool for the development of novel anti-angiogenesis therapeutic approaches for disesase with an angiogenic component

Clasificación, manejo y complicaciones de los hemangiomas de la infancia / Classification, treatment and complications of infantile hemangiomas

Los hemangiomas de la infancia o hemangiomas infantiles, HI, son los tumores benignos más comunes en pediatría. Su diagnóstico y manejo combinan la ciencia y el arte. A pesar de su alta prevalencia en poblaciones pediátricas, aún hoy en día se desconoce el mecanismo por el cual estos tumores proliferan y se entiende poco el porque de su formación, por lo tanto el manejo óptimo sigue siendo controversial. En las manos de los pediatras muchas veces recae no solo el reconocer estos tumores, sino también la dura tarea de saber cuando se debe intervenir, o cuando se debe dejar que estos tumores involucionen por cuenta propia. En este artículo se brinda una atualización sobre la clasificación, manejo, tratamiento y complicaciones de los HI.

The Role of Angiostatin, Vascular Endothelial Growth Factor, Matrix Metalloproteinase 9 and 12 in the Angiogenesis of Hepatocellular Carcinoma / 대한간학회지

BACKGROUND/AIMS: Tumor angiogenesis, a major requirement for tumor growth and metastasis, is regulated by pro- and anti-angiogenic factors. Hepatocellular carcinoma (HCC) has become a common malignant tumor worldwide. It is characterized by a high vascularity. METHODS: We studied the immunohistochemical expression of angiostatin, vascular endothelial cell growth factor (VEGF), matrix metalloproteinase (MMP)-9 and MMP-12, and the relationship between these results and the microvessel density (MVD) in 48 HCC specimens. To determine whether HCC cells express angiostatin per se, we examined the expression of angiostatin, MMP-9 and MMP-12 by Western blotting in four HCC cell lines. RESULTS: Expression of angiostatin and MMP-12 (but not MMP-9) were strongly correlated with decreased MVD in HCCs (P=0.006, P=0.038, respectively). VEGF positive tumors showed a significantly higher MVD than VEGF negative tumors (P=0.01). We divided the 48 cases into the following four groups: group A, angiostatin (+), MMP-9 or -12 (+), and VEGF (-); group B, angiostatin (-) and VEGF (-); group C, angiostatin (+), MMP-9 or -12 (+), and VEGF (+); group D, angiostatin (-) and VEGF (+). There was a significant correlation with MVD among these groups (P<0.001). Angiostatin was detected by Western blotting in 2 out of 4 HCC cell lines and was associated with plasminogen and MMP expression. CONCLUSIONS: These results indicate that angiogenesis in HCC is a complex process involving multiple factors including angiostatin, VEGF, and MMP. Our results suggest that angiostatin is generated by MMP-mediated proteolysis of plasminogen in HCC cells.

Detección del herpes virus humano 8 en pacientes con mieloma múltiple / HHV8 in patients with multiple myeloma

Objetivos: Evaluar la presencia del herpes virus en 8 pacientes con mieloma múltiple y en pacientes control, y en otras enfermedades hematológicas. Secundariamente determinar su relación con factores pronósticos y con la respuesta al tratamiento. Materiales y Métodos: Se incluirán 20 pacientes con diagnóstico de mieloma múltiple y 40 pacientes control. Se determinará en las biopsias de médula ósea al patrón y porcentaje de infiltración por células neoplásicas y el grado de angiogénesis. Se evaluará la presencia del virus en las biopsias y aspirados de médula ósea a través del método de PCR, al igual que en muestras de sangre periférica, donde también se realizará la determinación de anticuerpos contra el virus. En las biopsias se realizará hibridación in situ e inmunomarcación para caracterizar la estirpe celular de la población positiva. Resultados: Se han incorporado 28 pacientes; 13 tienen diagnóstico de mieloma múltiple y 15 pertenecen al grupo control. En las muestras de aspirado de médula ósea se realizó la búsqueda del ADN viral por la técnica de PCR sin encontrarse hasta el momento resultados positivos. Conclusiones: El estudio continúa en el período de recolección de datos; los resultados obtenidos del análisis por PCR en los aspirados de médula ósea concuerdan con la bibliografía internacional.

Estudio de algunos parámetros bioquímicos y de la actividad angiogénica del omentum / Study of some biochemical parameters and of the omentuïs angiogenic activity

Se estudió el efecto angiogénico y la composición de proteínas y lípidos del omentum humano a partir de la inoculación intraestomal en la córnea de conejo de los extractos obteniodos tras homogeneizar el material biológico. Se encontraron valores muy bajos de proteínas y muy elevados de triglicéridos fundamentalmente en el extracto 2 de origen lípidico. En relación con la vascularización, ésta se logró con mayor intensidad en la córnea de los animales que se inocularon con el extracto 2